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目标获取

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从基因文库中获取

①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。

②基因文库的种类：1、基因组文库；2、部分基因文库。

利用PCR技术扩增目的基因

①PCR含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核糖合成技术。全称是多聚酶链式反应。

②PCR原理：DNA双链复制。

③前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。

④扩增过程：目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，在DNA聚合酶的作用下进行延伸，如此重复循环多次。

⑤结果：每次循环后的目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增。

人工合成

如果基因较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。

技术比较

载体构建

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组成

1、目的基因；2、启动子；3、终止子；4、标记基因。

功能

1、使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；2、使目的基因能够表达和发挥作用。

步骤

⑴、用一定的限制酶切割质粒，使之出现一个黏性末端切口。

⑵、用同种限制酶切割目的基因，产生相同的黏性末端。

⑶、将目的基因片段插入质粒切口，加入适量DNA连接酶，使目的基因与质粒形成重组质粒。

⑷、基因表达载体的构成：目的基因+启动子+终止子+标记基因

目标导入

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转化

目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

受体种类

⑴、微生物：细菌细胞

⑵、植物细胞：卵细胞、受精卵、体细胞

⑶、动物细胞：受精卵、胚胎细胞

导入方法

⑴、微生物：感受态细胞法

①、感受态细胞：指细菌细胞经过Ca2+处理后，细胞壁透性增强，能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态。

②、过程：CaCl2+处理细胞 → 感受态细胞 → 表达载体与感受态细胞混合 → 感受态细胞吸收DNA分子。

⑵、植物细胞：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法

①、农杆菌：土壤微生物，易感染双子叶植物和裸子植物；对大多数单子叶植物没有感染力。

②、Ti质粒的T_DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体DNA上。

③、过程：目的基因插入T_DNA，T_DNA进入农杆菌，将农杆菌导入植物细胞。

⑶、动物细胞：显微注射法

①、目的基因表达载体经过提纯备用，取得受体动物的卵（或受精卵）备用。

②、采用显微注射技术将目的基因表达载体注射到卵（或受精卵）中。

③、培养液培养成为早期胚胎。

④、将早期胚胎移植到雌性动物子宫内，发育成新个体。

检测鉴定

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⑴、检测：

①、导入检测：检测受体细胞染色体DNA上是否含有目的基因。

DNA分子杂交法（DNA探针法）。

②、表达检测：检测目的基因是否完成转录出mRNA。

分子杂交法检测RNA。

检测目的基因是否完成表达翻译成蛋白质。

提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原——抗体杂交。

⑵、鉴定：个体生物学水平鉴定，鉴定抗性等。

参考：

基因工程的基本操作程序^[1]